DM118 GENERICHE - COMPLESSIVA PER IL CORSO
- Studio degli effetti del siponimod sulla tossicità sinaptica mediata dai linfociti in modelli sperimentali di Sclerosi Multipla.
Ente finanziatore: PNRR
Background e razionale: La Sclerosi Multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica e neurodegenerativa che colpisce maggiormente i giovani adulti. A seguito della rottura della barriera ematoencefalica, cellule linfocitarie auto-reattive T e B si infiltrano nel sistema nervoso centrale (CNS) ed innescano una cascata di eventi infiammatori che portano a demielinizzazione, perdita assonale, perdita di contatti sinaptici e quindi a neurodegenerazione. Le lesioni della sostanza bianca e grigia possono presentarsi in varie aree del CNS causando una manifestazione eterogenea dei sintomi, dai deficit motori ai disturbi cognitivi e dell’umore.
Studi recenti nella SM e nel modello SM di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) hanno mostrato l’esistenza di una precoce sinaptopatia infiammatoria, indipendente dalla demielinizzazione, caratterizzata da uno sbilanciamento della trasmissione sinaptica a favore di quella glutammatergica. La sinaptopatia, a sua volta, causa eccitotossicità, contribuendo all’irreversibile morte neuronale. D’altro canto, a causa della natura molto plastica delle sinapsi, la disfunzione sinaptica è un processo reversibile e, come tale, sta emergendo come un possibile bersaglio terapeutico.
La sinaptopatia infiammatoria è il risultato di un’aberrante alterazione della trasmissione sinaptica indotta da citochine infiammatorie rilasciate dalle cellule immunitarie (linfociti, microglia), ed è osservabile in diverse aree del cervello di topi EAE. Inoltre, dati recenti derivati da un modello traslazionale chimerico uomo-topo, ottenuto incubando linfociti T di pazienti SM su fettine corticostriatali murine (modello chimerico di SM), hanno mostrato che i linfociti T di pazienti con SM attiva, rispetto a quelli con SM non attiva e soggetti sani (HS), inducono un potenziamento TNF-dipendente della trasmissione glutammatergica striatale (Gentile et al., 2020). Dati preliminari nel modello chimerico eterologo mostrano che linfociti T isolati da pazienti con diagnosi di SM progressiva esercitano un effetto sinaptico ancor più eccito tossico dovuto ad un’alterazione delle correnti spontanee glutammatergiche sia a livello di cinetiche che di frequenze .
La sinaptopatia mediata dalle cellule T sembra essere dunque un possibile bersaglio terapeutico nella SM ed il modello chimerico è un valido tool per testare il potenziale effetto anti-sinaptotossico delle attuali disease modifying terapyes (DMTs). Le terapie più recenti prevedono l’uso di anticorpi monoclonali e modulatori del recettore della sfingosina-1-fosfato (S1P). Tra quest’ultimi ritroviamo il siponimod, modulatore S1P1/5 recentemente approvato per il trattamento della forma più disabilitante della patologia, quella secondariamente progressiva, e che insieme agli altri modulatori sfingosinici sembra essere molto promettente sia per l’azione immunomodulante che per un effetto neuroprotettivo osservato nel modello EAE.
Dati preliminari ottenuti di recente hanno messo in evidenzia il ruolo protettivo del siponimod sia in un modello chimerico omologo di EAE (topo-topo) che nel modello chimerico eterologo di SM (uomo-topo). Nel modello chimerico omogolo, è emerso che le fettine corticostriatali di topo sano, incubate con i linfociti trattati con siponimod, non subiscono il danno sinaptico-mediato dalle cellule T. Inoltre, ulteriori esperimenti effettuati con specifici agonisti ed antagonisti dei recettori S1P suggeriscono una modulazione specifica del recettore S1P5 da parte del Siponimod. Infine, a supporto di tali risultati, l’utilizzo del modello chimerico eterologo ha mostrato che i linfociti T derivati da pazienti progressivi trattati con siponimod sono in grado, in buona parte, di recuperare la sinaptopatia-mediata da cellule T. I mediatori coinvolti sono in corso di valutazione.
Obiettivi del progetto: il presente progetto mira ad indagare il potenziale effetto sinaptotossico dei linfociti B derivati dai topi EAE o dai pazienti SM progressivi nei rispettivi modelli chimerici, e di studiare l’effetto anti-sinaptotossico dei modulatori sfingosinici, in particolare del siponimod. Numerosi dati in letteratura mostrano sempre più un ruolo patogenetico delle cellule B nelle forme progressive di SM. Nelle meningi e nel liquido cerebrospinale di casi di SM post-mortem rapidamente progressiva con un alto grado di infiammazione meningea e un'elevata percentuale di demielinizzazione GM, è stato riscontrato l'aumento dell'espressione di mediatori infiammatori, come IFN, TNF e IL22, e di molecole associate all'attività sostenuta delle cellule B e alla neogenesi linfoide, suggerendo un’azione sinaptotossica infiammatoria delle cellule B.
Gli obiettivi specifici della ricerca sono i seguenti:
1. Indagare l’effetto del trattamento con Siponimod sulla tossicità dei linfociti B derivati dal topo EAE (modello chimerico omologo topo-topo) . I linfociti isolati dalla milza di topi EAE saranno quindi trattati con il farmaco o con il veicolo e successivamente incubati su fettine corticostriatali di topo per valutarne l’impatto sulla trasmissione sinaptica eccitatoria dei neuroni spinosi dello striato utilizzando la tecnica del patch-clamp. Inoltre identificheremo gli specifici sottotipi dei recettori sfingosinici (agonisti S1P1-S1P5; Siponimod e veicolo per i due diversi antagonisti) coinvolti. Infine, sugli stessi gruppi sperimentali, saranno eseguite delle analisi biochimiche in vitro sul terreno di cultura dei linfociti, al fine di caratterizzare le modulazioni del profilo citochinico a seguito del trattamento.
2. Indagare l’effetto del trattamento con siponimod sulla tossicità dei linfociti B derivati dai pazienti progressivi SM (modello chimerico eterologo uomo-topo – linfociti B) . I linfociti isolati dal sangue dei pazienti SM saranno quindi trattati con il farmaco o con il veicolo e successivamente incubati su fettine corticostriatali di topo per valutarne l’impatto sulla trasmissione sinaptica eccitatoria dei neuroni spinosi dello striato utilizzando la tecnica del patch-clamp. Inoltre identificheremo gli specifici sottotipi dei recettori sfingosinici (agonisti S1P1-S1P5; Siponimod e veicolo per i due diversi antagonisti) coinvolti. Infine, sugli stessi gruppi sperimentali, saranno eseguite delle analisi biochimiche in vitro sul terreno di cultura dei linfociti, al fine di caratterizzare le modulazioni delle citochine ed il profilo del fenotipo linfocitario dopo trattamento.
L’emergere di un potenziale effetto anti-sinaptotossico da parte dei farmaci immunomodulanti, come il Siponimod,mediato da un’azione sui linfociti infiltranti, sia T che B, potrebbe aprire nuove strade per la progettazione di farmaci sempre più efficaci nella SM e contribuirebbe a chiarire la correlazione tra neuroinfiammazione e neurodegenerazione tipica di diverse patologie del SNC.
Competenze richieste: Diploma di laurea specialistica (LS), ovvero diploma di laurea magistrale (LM) in Neurobiologia; comprovata esperienza in biologia cellulare e immunoistochimica; comprovata esperienza nel campo della neurofisiologia, in particolare nell’utilizzo della tecnica del patch clamp; esperienza nell’utilizzo di animali da laboratorio.
- Study of the effects of siponimod on lymphocyte-mediated synaptic toxicity in experimental models of Multiple Sclerosis
Background and Rationale: Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory and neurodegenerative disease that primarily affects young adults. Following the breakdown of the blood-brain barrier, self-reactive T and B lymphocytes infiltrate the central nervous system (CNS) and trigger a cascade of inflammatory events that lead to demyelination, axonal loss, synaptic contacts disruption, and ultimately neurodegeneration. White and gray matter lesions can occur in various areas of the CNS, resulting in a heterogeneous manifestation of symptoms, ranging from motor deficits to cognitive and mood disturbances.
Recent studies in MS and the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS have shown the existence of early inflammatory synaptopathy, independent of demyelination, characterized by an imbalance in synaptic transmission favoring glutamatergic transmission. The synaptopathy, in turn, causes excitotoxicity, contributing to irreversible neuronal death. On the other hand, due to the highly plastic nature of synapses, synaptic dysfunction is a reversible process and is emerging as a potential therapeutic target.
Inflammatory synaptopathy results from an aberrant alteration of synaptic transmission induced by inflammatory cytokines released by immune cells (lymphocytes, microglia) and can be observed in various brain regions of EAE mice. Furthermore, recent data derived from a translational human-mouse chmeric model, obtained by incubating T lymphocytes from MS patients on murine corticostriatal slices (chimeric MS model), have shown that T lymphocytes from patients with active MS, compared to those with non-active MS and healthy subjects, induce a TNF-dependent potentiation of striatal glutamatergic transmission (Gentile et al., 2020). Preliminary data in the heterologous chimeric model show that T lymphocytes isolated from patients diagnosed with progressive MS exert an even more excitotoxic synaptic effect due to an alteration of spontaneous glutamatergic currents, both in kinetics and frequencies parameters.
T-cell-mediated synaptopathy appears to be a potential therapeutic target in MS, and the chimeric model is a valuable tool to test the potential anti-synaptotoxic effect of current disease-modifying therapies (DMTs). The most recent therapies involve the use of monoclonal antibodies and modulators of the sphingosine-1-phosphate receptor (S1P). Among the latter, siponimod, an S1P1/5 modulator recently approved for the treatment of the most disabling form of the disease, secondary progressive MS, along with other sphingosine modulators, seems to be very promising both for its immunomodulatory action and for a neuroprotective effect observed in the EAE model.
The recent preliminary data have highlighted the protective role of siponimod in both a homologous EAE chimeric model (mouse-mouse) and in the heterologous MS chimera model (human-mouse). In the homologous chimera model, it was found that healthy mouse corticostriatal slices, incubated with siponimod-treated lymphocytes, did not undergo T cell-mediated synaptic damage. Furthermore, additional experiments conducted with specific agonists and antagonists of S1P receptors suggest a specific modulation of the S1P5 receptor by siponimod. Finally, in support of these results, the use of the heterologous chimera model has shown that T lymphocytes derived from progressive MS patients treated with siponimod are able to largely recover T cell-mediated synaptopathy. The mediators involved are currently being evaluated.
Project Objectives: The present project aims to investigate the potential synaptotoxic effect of B lymphocytes derived from EAE mice or progressive MS patients in their respective chimera models, and to study the anti-synaptotoxic effect of sphingosine modulators, particularly siponimod. Numerous literature data increasingly show a pathogenic role of B cells in progressive forms of MS. In the meninges and cerebrospinal fluid of rapidly progressive MS cases with high meningeal inflammation and a high percentage of gray matter demyelination, increased expression of inflammatory mediators such as IFN, TNF, and IL22, as well as molecules associated with B cell activity and lymphoid neogenesis, has been observed, suggesting an inflammatory synaptotoxic action of B cells.
The specific research objectives are as follows:
Aim1: To investigate the effect of siponimod treatment on the toxicity of B lymphocytes derived from EAE mice (homologous mouse-to-mouse chimera model). Lymphocytes isolated from the spleen of EAE mice will be treated with the drug or vehicle and then incubated on mouse brain slices to assess their impact on excitatory synaptic transmission of striatal spiny neurons using the patch-clamp technique. Furthermore, we will identify the specific subtypes of sphingosine receptors (S1P1-S1P5 agonists; siponimod and vehicle for the two different antagonists) involved. Finally, biochemical analyses will be performed in vitro on the lymphocyte culture medium of the experimental groups to characterize the modulation of the cytokine profile following treatment.
Aim2: to investigate the effect of siponimod treatment on the toxicity of B lymphocytes derived from progressive MS patients (heterologous human-to-mouse chimera model - B lymphocytes). Lymphocytes isolated from the blood of MS patients will be treated with the drug or vehicle and then incubated on mouse brain slices to assess their impact on excitatory synaptic transmission of neurons using the patch-clamp technique. Furthermore, we will identify the specific subtypes of sphingosine receptors (S1P1-S1P5 agonists; siponimod and vehicle for the two different antagonists) involved. Finally, biochemical analyses will be performed in vitro on the lymphocyte culture medium of the experimental groups to characterize cytokine modulations and the lymphocyte phenotype profile after treatment.
The emerging potential anti-synaptotoxic effect of immunomodulatory drugs, such as siponimod, mediated by action on infiltrating T and B lymphocytes, could open new avenues for the design of increasingly effective drugs in MS and contribute to clarifying the correlation between neuroinflammation and neurodegeneration typical of various CNS pathologies.
Skills: Master Degree in Neurobiology; certified experience in cell biology and immunoistochemistry; certified experience in neurophysiology research, in the use of patch clamp technique; experience in using experimental animal models.
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DM118 GENERICHE - COMPLESSIVA PER IL CORSO
- Un Nuovo approccio terapeutico per la Sindrome dell’X Fragile
Ente finanziatore: PNRR
La Sindrome dell’X Fragile (FXS) è la forma più comune di disabilità intellettiva ereditaria e una delle principali cause di autismo dovuta all'assenza della proteina Fragile X Messenger Ribonucleoprotein (FMRP), codificata dal gene FMR1. Ad oggi l’FXS non è curabile, nonostante i numerosi studi (pre) clinici intrapresi (PMID: 31045620, PMID: 35216055). L’utilizzo di acidi nucleici sta emergendo come nuova strategia per la cura di una vasta gamma di malattie. Infatti, l’enorme successo dei vaccini basati sull’mRNA nella recente epidemia di Coronavirus (PMID: 35130825) ha aperto nuove promettenti prospettive per la cura di altre malattie, incluse rare patologie monogeniche, caratterizzate dall’assenza di una specifica proteina. In questi casi, gli mRNA che codificano la proteina mancante, possono essere trasporti in nanocarrier, come le nanoparticelle lipidiche, e reinseriti all’interno delle cellule bersaglio della patologia (PMID: 31179759; PMID: 30796097). A differenza della terapia genica a DNA, l’mRNA persiste nella cellula per un tempo limitato, non si integra nel DNA e non causa quindi modifiche permanenti nel genoma della cellula ospite.
Questo progetto propone l’utilizzo dell’mRNA di FMR1 per la cura della FXS. Il progetto sarà sviluppato con esperimenti in vitro e in vivo. Gli studi in vitro saranno condotti trattando linee cellulari derivate da pazienti FXS (fibroblasti, neuroni differenziati da cellule staminali pluripotenti indotte) e da modelli animali della sindrome (fibroblasti e neuroni) con l’mRNA di FMR1. Verrà valutata la potenziale correzione delle alterazioni molecolari e cellulari tipiche della sindrome, come l’eccessivo livello della sintesi proteica e la morfologia immatura delle spine dendritiche. Inoltre, l’mRNA di FMR1 verrà somministrato direttamente nel cervello di topi FXS al fine di esaminarne in vivo i potenziali effetti benefici sui disordini comportamentali associati alla sindrome, come le stereotipie comportamentali e la scarsa socialità. Per rendere questo trattamento quanto più traslabile saranno testate diverse vie sistemiche di somministrazione dell'mRNA nel modello in vivo.
Competenze richieste: Diploma di laurea specialistica (LS), ovvero diploma di laurea magistrale (LM) in Biologia Cellulare e Molecolare. Per i titoli di studio conseguiti all’estero, l’equipollenza sarà riconosciuta dalla Commissione giudicatrice.
- Curriculum formativo, scientifico e professionale adeguato allo svolgimento dello specifico programma oggetto della borsa. La valutazione del citato curriculum, ai fini dell’ammissione alla selezione, verrà effettuata dalla commissione giudicatrice.
- A new therapeutic approach for the Fragile X Syndrome
Fragile X Syndrome (FXS) is the most common form of inherited intellectual disability and a major cause of autism, due to the absence of the Fragile X Messenger Ribonucleoprotein (FMRP), encoded by the FMR1 gene. To date, no cure is available for FXS, despite several (pre) clinical studies performed (PMID: 31045620, PMID: 35216055). Recently, the use of nucleic acids is emerging as a new strategy for the treatment of a wide range of diseases. In fact, the tremendous success of mRNA-based vaccines in the recent Coronavirus outbreak (PMID: 35130825) has opened new promising perspectives for the treatment of other diseases, including rare monogenic pathologies characterized by the absence of a specific protein. In these cases, the mRNA molecules encoding the missing protein can be transported in nanocarriers, such as lipid nanoparticles, and reintroduced within the target cells of the disease (PMID: 31179759; PMID: 30796097).
Unlike DNA gene therapy, mRNA persists in the cell for a limited time, does not integrate into DNA, and thus does not cause permanent changes in the host genome.
This project proposes the use the mRNA-based therapy to treat FXS. The project will be developed by means of in vitro and in vivo experiments. The in vitro studies will be carried out by treating cell lines derived from FXS subjects (fibroblasts, neurons differentiated from induced pluripotent stem cells) and from animal models of the syndrome (fibroblasts and neurons) with the FMR1 mRNA. The potential correction of the molecular and cellular phenotypes typical of the syndrome, such as the exaggerated protein synthesis level and the immature dendritic spine morphology, will be evaluated. In addition, FMR1-mRNA will be administered directly into the brain of FXS mice in order to investigate in vivo its potential beneficial effects on behavioral disorders associated with the syndrome, including the behavioral stereotypies and the reduced sociability. To improve translatability different systemic routes of mRNA administration will be tested in the in vivo model.
Skills: - Master's degree in Cellular and Molecular Biology. Equivalence for degrees obtained abroad will be recognized by the selection committee.
- Educational, scientific, and professional curriculum that is suitable for carrying out the specific program covered by the fellowship. The evaluation of the aforementioned curriculum, for the purpose of admission to the selection process, will be conducted by the selection committee.
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