DM118 GENERICHE - COMPLESSIVA PER IL CORSO
- Ingegnerizzazione di cellule Natural Killer come nuova immunoterapia dei tumori solidi
Ente finanziatore: PNRR
Le cellule Natural Killer (NK), linfociti citotossici appartenenti all'immunità innata, sono tolleranti nei confronti delle cellule sane ed in grado di riconoscere ed uccidere le cellule infettate da virus e le cellule tumorali attraverso il rilascio di granuli citolitici e citochine citotossiche. La peculiare capacità di suscitare una potente risposta contro le cellule bersaglio è dovuta all'espressione da parte delle cellule NK di un repertorio di recettori attivatori come NKG2D, la molecola accessoria DNAX (DNAM-1, CD226) e i recettori naturali di citotossicità (NCR), tra cui NKp30, NKp44 e NKp46. I ligandi per NKG2D e DNAM-1 sono scarsamente espressi nelle cellule normali ed altamente espressi nelle cellule infettate da virus e trasformate. Inoltre, le cellule NK, attraverso l'espressione del recettore FcgRIIIA (CD16), sono responsabili della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), funzione cruciale nel contesto clinico di tutte le immunoterapie che prevedono l’uso di anticorpi monoclonali (mAb). Al contrario, è degno di nota il fatto che le cellule NK nei pazienti oncologici mostrino funzioni compromesse accompagnate da una scarsa capacità di infiltrare il microambiente tumorale (TME), poiché le cellule tumorali adottano diversi meccanismi di evasione immunitaria. Pertanto, il trasferimento adottivo di cellule NK allogeniche espanse e attivate ex vivo per l'immunoterapia risulta essere una strategica applicazione clinica per aiutare i pazienti oncologici a combattere le cellule tumorali.Le cellule NK allogeniche ed alloreattive primarie, provenienti da donatori sani con un mismatch favorevole tra recettore immunoglobulino-simile (KIR) e antigene leucocitario umano (HLA), rispetto all'uso terapeutico delle cellule T, presentano diversi vantaggi: le cellule NK allogeniche non causano la malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD) e presentano un basso rischio di proliferazione nei pazienti trasfusi e, quindi, una maggiore sicurezza rispetto alle cellule T infuse. Ciò ha progressivamente stimolato il miglioramento dei metodi di amplificazione ex vivo delle cellule NK, precedentemente limitati, e i progetti per l'espressione di vari recettori chimerici dell'antigene (CAR) e recettori chimerici NKG2D adatti all'uso clinico (ClinilTrial.gov). L'elevata disponibilità di cellule NK allogeniche, il loro basso costo rispetto alle cellule CAR-T e la possibilità di crioconservarle per una successiva somministrazione, consentendo il trattamento di molti pazienti da un unico donatore di NK, ne favorisce l'uso clinico per diversi tipi di tumore.Finora, è stato ampiamente riportato il successo dell'uso di cellule NK ingegnerizzate per diversi CAR e per il recettore chimerico NKG2D in ambito tumorale. Sulla base del successo delle cellule CAR-T mirate al CD19, approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) statunitense, le prime cellule CAR-NK sono state ingegnerizzate con un frammento chimerico anti-CD19 a catena singola variabile (scFv) per la cura delle neoplasie ematologiche. Attualmente, l'uso di cellule NK modificate con recettori chimerici CAR o NKG2D è stato esteso a diversi tipi di tumore; tuttavia, il numero di studi clinici che ne hanno valutato l'efficacia contro i tumori solidi è di gran lunga inferiore a quello dei tumori maligni ematologici. Ciò rappresenta una lacuna clinica che deve essere colmata. Pertanto, per migliorare l'efficacia del trasferimento adottivo di cellule CAR-NK per l'immunoterapia dei tumori solidi, la ricerca di molecole bersaglio tumorali più specifiche, accompagnata da meccanismi che superino le barriere del TME, deve essere ancora ampiamente esplorata.Per colmare questa lacuna, recentemente abbiamo fornito risultati promettenti in vitro sull'efficacia di cellule NK ingegnerizzate per un recettore chimerico DNAM-1 contro il neuroblastoma (NB). Alla luce di questo studio proof-of-concept lo scopo di questa proposta progettuale è di ottimizzare il costrutto chimerico basato su DNAM-1 con l'obiettivo di sviluppare cellule NK ingegnerizzate stabilmente per il recettore chimerico DNAM-1, altamente efficienti da impiegare in studi preclinici e in prospettiche sperimentazioni cliniche dirette principalmente contro i tumori solidi. Tecniche di biologia cellulare, citofluorimetria, analisi funzionale e indagini in vitro ed in vivo in modelli murini consentiranno di poter esplorare la funzione delle cellule NK ingegnerizzate per DNAM-1 chimerico contro diversi modelli di tumori solidi. Titolo del progetto: Identificazione di nuovi farmaci immunomodulanti per l’immunoterapia dei tumori solidi basata sull’uso di cellule Natural Killer.Lo sviluppo del tumore è il risultato della combinazione di meccanismi molecolari che inducono la promozione della crescita tumorale, l'angiogenesi tumorale, la generazione ed il mantenimento del microambiente immunosoppressivo accompagnati dall'evasione dalla risposta immunitaria innata e adattativa. Inoltre, importante da considerare, la progressione tumorale è favorita anche da una concomitante riduzione del numero di cellule immunitarie effettrici, comprese le cellule Natural Killer (NK), tipica di molti pazienti oncologici. Le cellule NK appartengono all’immunità innata e svolgono un ruolo essenziale nella lotta contro il cancro. L’immunoterapia del cancro basata sulla funzione delle cellule NK ha acquisito grande interesse negli ultimi anni. Infatti, il trasferimento adottivo di cellule NK attivate ex vivo autologhe o allogeniche, rappresenta una promettente strategia terapeutica cellulare per la cura del cancro. Diversi studi preclinici e alcuni studi clinici hanno recentemente dimostrato la capacità delle cellule NK, trasferite adottivamente, di inibire e bloccare la progressione del tumore, specialmente nel trattamento delle neoplasie ematopoietiche. Nonostante siano stati inoltre promettenti i risultati ottenuti nel contesto dei tumori solidi, l’immunosoppressione tipica del microambiente tumorale e la barriera ad una adeguata infiltrazione linfocitaria rimangono in molti casi come limiti da superare. Generalmente, le cellule NK trasferite sono ben tollerate e infatti non causano la malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD), una condizione compromettente che si verifica di frequenza nei pazienti oncologici dopo il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) o il trapianto di cellule T. Recenti studi hanno indicato che la chemioterapia e la radioterapia possono funzionare come potenti adiuvanti immunitari promuovendo l'attivazione immunitaria antitumorale dell'ospite, ad esempio attraverso l'induzione della morte delle cellule tumorali citotossiche immunogeniche. In tale scenario, i farmaci immunomodulanti (IMiD) che consentono una maggiore espressione sulle cellule tumorali di ligandi per i recettori attivatori espressi sulle cellule NK dovrebbero migliorare il riconoscimento delle cellule tumorali da parte delle cellule NK endogene, ponendo così le basi per aumentare l'efficacia antitumorale di NK trasferite nell'ospite. Nei tumori solidi, un maggiore reclutamento di cellule NK nel sito del tumore consentirebbe una risposta immunitaria antitumorale più robusta e potrebbe quindi essere utilizzato clinicamente per migliorare la prognosi del paziente. Finora, studi preclinici e clinici hanno dimostrato che gli anticorpi contro gli inibitori del checkpoint immunitario (PD-1, PD-L1, CLTA4, etc) migliorano il contributo delle cellule NK alla risposta immunitaria antitumorale. L'uso combinato di strategie molecolari, volte sia ad aumentare la suscettibilità del tumore all'uccisione delle cellule NK che quelle volte a migliorare l'efficienza delle cellule NK trasferite adottivamente, potrebbe rappresentare un nuovo approccio per il trattamento del cancro, non solo ematologico, ma anche dei tumori solidi. Recentemente abbiamo identificato come Nutlin3a, un noto inibitore di MDM2 capace di ripristinare la funzione di p53, come anche la combinazione di citochine come TNF ed IFN, possano avere effetti immunomodulanti rendendo le cellule di tumori solidi più suscettibili alla morte mediata da parte delle cellule NK. Lo scopo del presente progetto è di potenziare l’attività anti-tumorale delle cellule NK contro diverse forme di tumori solidi, come cancro al seno o testa collo, attraverso l’identificazione di nuove droghe o citochine immunomodulanti. Tecniche di biologia cellulare, citofluorimetria, analisi funzionale, consentiranno di poter esplorare la funzione delle cellule NK contro diversi modelli di tumori solidi. In particolare, si prevede l’isolamento delle cellule NK da donatori sani, la loro caratterizzazione fenotipica l’espansione tramite tecniche di coltura appropriate e saggi funzionali contro linee di cellule tumorali o cellule primarie, isolate da biopsie, trattate con agenti immunomodulanti. Inoltre si prevede di generare sferoidi da linee cellulari tumorali o organoidi da cellule tumorali primarie in modo da testare la capacita delle cellule NK di infiltrare i tumori tramite tecniche di immunoistochimica e microscopia a fluorescenza ed uso di devise di microfluidica. Il readout funzionale delle cellule NK in vitro verrà traslato in un modello di xenograft murino per uno studio preclinico con la prospettiva di un disegno clinico. Referenze- Focaccetti, C., Benvenuto, M., Pighi, C., ...Bei, R., Cifaldi, L. (2022). DNAM-1-chimeric receptor-engineered NK cells, combined with Nutlin-3a, more effectively fight neuroblastoma cells in vitro: a proof-of-concept study. Frontiers in Immunology, 13, 886319.- Brandetti, E., Focaccetti, C., Pezzolo, A., ...Bei, R., Cifaldi, L. (2021) Enhancement of neuroblastoma NK-cell-mediated lysis through NF-kB p65 subunit-induced expression of FAS and PVR, the loss of which is associated with poor patient outcome. Cancers, 13(17), 4368.- Veneziani, I., Infante, P., Ferretti, E., Melaiu, O., Battistelli, C., Lucarini, V., et al. (2021). Nutlin-3a Enhances Natural Killer Cell-Mediated Killing of Neuroblastoma by Restoring p53-Dependent Expression of Ligands for NKG2D and DNAM-1 Receptors. CANCER IMMUNOLOGY RESEARCH [10.1158/2326-6066.cir-20-0313].- Melaiu, O., Lucarini, V., Cifaldi, L., & Fruci, D. (2019). Influence of the Tumor Microenvironment on NK Cell Function in Solid Tumors. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, 10, 3038.- Cifaldi, L., Locatelli, F., Marasco, E., Moretta, L., & Pistoia, V. (2017). Boosting Natural Killer Cell-Based Immunotherapy with Anticancer Drugs: a Perspective. TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, 23(12), 1156-1175.- Brandetti, E., Veneziani, I., Melaiu, O., Pezzolo, A., Castellano, A., Boldrini, R., et al. (2017). MYCN is an immunosuppressive oncogene dampening the expression of ligands for NK-cell-activating receptors in human high-risk neuroblastoma. ONCOIMMUNOLOGY, 6(6), e1316439.
Competenze richieste: Conoscenza di base delle tecniche di immunoterapia
- Engineering Natural Killer cells as a new immunotherapy of solid tumors
Natural Killer (NK) cells, cytotoxic lymphocytes belonging to innate immunity, are tolerant of healthy cells and able to recognize and kill virus-infected cells and tumor cells through the release of cytolytic granules and cytotoxic cytokines. The peculiar ability to elicit a powerful response against target cells is due to NK cells' expression of a repertoire of activating receptors such as NKG2D, the accessory molecule DNAX (DNAM-1, CD226) and natural cytotoxicity receptors (NCRs), including NKp30, NKp44 and NKp46. The ligands for NKG2D and DNAM-1 are poorly expressed in normal cells and highly expressed in virus-infected and transformed cells. Furthermore, NK cells, through the expression of the FcRIIIA receptor (CD16), are responsible for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), a crucial function in the clinical context of all immunotherapies involving monoclonal antibodies (mAb). In contrast, it is noteworthy that NK cells in cancer patients show impaired functions accompanied by a poor ability to infiltrate the tumor microenvironment (TME), as tumor cells adopt different immune evasion mechanisms. Therefore, adoptive transfer of expanded and ex vivo activated allogeneic NK cells for immunotherapy appears to be a strategic clinical application to help cancer patients fight tumor cells. Primary allogeneic and alloreactive NK cells from healthy donors with a favorable mismatch between immunoglobulin-like receptor (KIR) and human leukocyte antigen (HLA), compared to the therapeutic use of T-cells, have several advantages: allogeneic NK cells do not cause graft-versus-host disease (GvHD) and have a low risk of proliferation in transfused patients and, thus, greater safety compared to infused T-cells. This has progressively stimulated the improvement of previously limited ex vivo amplification methods of NK cells and projects for the expression of various chimeric antigen receptors (CARs) and chimeric NKG2D receptors suitable for clinical use (ClinilTrial.gov). The high availability of allogeneic NK cells, their low cost compared to CAR-T cells, and the possibility of cryopreserving them for later administration, enabling the treatment of many patients from a single NK donor, favors their clinical use for different tumor types. To date, the successful use of NK cells engineered for different CARs and for the chimeric NKG2D receptor in the tumor setting has been widely reported. Based on the success of CD19-targeted CAR-T cells approved by the US Food and Drug Administration (FDA), the first CAR-NK cells were engineered with a chimeric anti-CD19 single-chain variable fragment (scFv) for the treatment of haematological malignancies. Currently, the use of NK cells modified with CAR or NKG2D chimeric receptors has been extended to several tumor types; however, the number of clinical trials evaluating their efficacy against solid tumors is far lower than for haematological malignancies. This represents a clinical gap that needs to be filled. Therefore, in order to improve the efficacy of adoptive transfer of CAR-NK cells for solid tumor immunotherapy, the search for more specific tumor target molecules, accompanied by mechanisms that overcome TME barriers, still needs to be extensively explored. To fill this gap, we recently provided promising in vitro results on the efficacy of NK cells engineered for a chimeric DNAM-1 receptor against neuroblastoma (NB). In light of this proof-of-concept study, the aim of this project proposal is to optimize the DNAM-1-based chimeric construct with the goal of developing stably engineered NK cells for the chimeric DNAM-1 receptor, which are highly efficient for use in preclinical studies and prospective clinical trials directed mainly against solid tumors. Cell biology techniques, cytofluorimetry, functional analysis and in vitro and in vivo investigations in mouse models will make it possible to explore the function of NK cells engineered for chimeric DNAM-1 against different solid tumor models.
Skills: Basic knowledge of immunotherapy techniques
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